限制性内切酶发展史上世纪 50 年代初期，许多研究团队观测到了噬菌体对于同一物种的不同细菌宿主菌株存在感染效率差异 [2,3]。Grasso 和 Paigen 对此的描述如下：使用在一种细菌菌株（例如，大肠杆菌 C）内繁殖的噬菌体 λ 感染同一种类的另一菌株（例如，大肠杆菌K），结果发现，相比于重新感染宿主菌株（大肠杆菌C），大肠杆菌 K 的感染率出现明显下降。新的宿主（大肠杆菌K）似乎可以选择性抵御或“耐受”侵入的噬菌体。研究人员还发现，这一现象并没有遗传性，因为经过一轮感染后，在新菌株中生长的噬菌体还可以以正常的感染率感染该菌株。这种现象被称为“宿主控制变异”，有关其背后的机制也成为了频繁研究的领域 [4]。

直到上世纪 60 年代，人们才发现宿主控制变异的机制，其与噬菌体 DNA 的酶切有关，进而发现并分离出了限制性内切酶。上世纪 60 年代初 Werner Arber 观测发现，宿主范围的决定性遗传物质都存在于噬菌体 DNA之中，而后续实验证明甲硫氨酸参与宿主的自我保护[5]。这些发现最终催生了限制性修饰 (R-M) 体系的概念，通过该体系，来自于宿主的限制性内切酶和甲基化酶共同作用，切割外来病毒（非甲基化） DNA，同时保护宿主的 DNA 不受甲基化 [6]。

颇为有趣的是，大多数 R-M 体系的早期研究工作围绕限制性内切酶的 Type I 和 Type III 基团进行，该分类方法主要依据限制性内切酶的结构和功能（参见限制性内切酶分类）。然而在 Kent Wilcox 和 Hamilton Smith 发现第一种 Type II 级限制性内切酶 HindII 之前，限制性内切酶显然还未得到充分利用[7]。HindII 能够识别特定的对称 DNA 序列，按照精确的方式切割识别序列内的位点。此功能（大多数早期 Type II 限制性内切酶均发现存在此功能）促使 Kathleen Danna 和 Daniel Nathans 使用 HindII 研究猿猴空泡病毒 40 DNA 物理图谱[8]，即所谓的限制性内切酶图谱。

凭借在限制性内切酶方面的开创性研究，Daniel Nathans、Hamilton Smith 和 Werner Arber 共同获得 1978 诺贝尔生理学或医学奖。随着 DNA 连接酶的发现以及位点特异性限制性内切酶家族不断壮大，重组 DNA 技术应运而生。